В темновой фазе фотосинтеза акцептированный СО₂ восстанавливается до углеводов благодаря энергии АТФ и НАДФ·Н, образующихся при световых реакциях. Темновые реакции контролируются ферментами. Последовательность этих реакций была определена американцами Кальвином, Бенсоном и Бэссемом и в 1961 г. Кальвину была присуждена за эту работу Нобелевская премия. В настоящее время известны три основных пути фиксации CO₂: С₃-путь (цикл Кальвина), С₄-путь и фотосинтез по типу толстянковых (САМ-метаболизм).

Характерной особенностью фотосинтетического восстановления СО₂ являются цикличность и разветвленность этого процесса. Цикличность обеспечивает высокую производительность, саморегуляцию и непрерывность образования углеводов. Разветвленность – образование разнообразных продуктов, дублирование путей регенерации акцептора СО₂.

 

Фиксация углекислого газа в цикле Кальвина-Бенсона

При исследовании фотосинтетического карбоксилирования одновременно решаются вопросы природы первичного акцептора углерода, природы устойчивого первичного продукта и природы фермента. Пути фиксации и превращения углерода в процессе фотосинтеза стали понятны благодаря развитию методов хроматографии в сочетании с применением радиоизотопа углерода С¹⁴. Опытами М. Кальвина, Дж. Бассема, Э. Бенсона было доказано, что первым устойчивым продуктом фотосинтеза является 3-фосфоглицериновая кислота.

Меченый углерод входит в состав карбоксильной группы. Акцептором углекислого газа оказалось пятиуглеродное соединение рибулезо-1,5-бифосфат, а не двухуглеродное, как предполагали вначале. Объектами исследований, которые позволили добиться первых успехов в изучении реакций фотосинтетической фиксации углекислого газа, были зеленые микроводоросли рода Chlorella. Успех обеспечили условия проведения экспериментов: включение-выключение света, быстрое снижение концентрации СО₂ от 1 % до 0,003 %.

Группа ученых во главе с М. Кальвином установила, что фотосинтетическая ассимиляция углерода является темновым циклическим ферментативным процессом, в ходе которого расходуется энергия синтезированх во время световой стадии соединений (АТФ и НАДФН+Н), образуются конечные продукты и регенерируется молекула первичного акцептора углерода. Позднее выяснилось, что по такому принципу устроены и другие пути фотосинтетического усвоения СО₂ или остатка угольной кислоты.

Цикл Кальвина или С₃-путь фиксации СО₂ состоит из трех этапов: карбоксилирования, восстановления и регенерации акцептора СО₂ . Реакция карбоксилирования молекулы рибулозо-1,5-бифосфата с образованием двух молекул 3-фосфоглицериновой кислоты (3-ФГК), по-видимому, требует превращения молекулы рибулозо-1,5-бифосфата в активную енольную форму, присоединения СО2 ко второму атому углерода с образованием нестойкой β-кетокислоты и ее последующего гидролиза. Реакцию катализирует фермент рибулобисфосфаткарбоксилаза (РДФК).

Путь превращения 3-ФГК считают центральным звеном в фотосинтетическом цикле углерода. Сначала из 3-ФГК с участием фермента фосфоглицераткиназы и АТФ образуется 1,3-дифосфоглицериновая кислота (1,3-ДФГК) с макроэргической связью. Далее фермент триозофосфатдегидрогена-за с участием НАДФН+Н восстанавливает 1,3-ДФГК д о 3 -фосфоглицеринового альдегида (3-ФГА). Таким образом, в реакциях превращения 3-ФГК в 3-ФГА расходуются богатые энергией продукты световой фазы фотосинтеза: 2 молекулы НАДФН+Н и 2 молекулы АТФ.

Дальнейшие реакции цикла направлены на превращение трехуглеродных соединений (3-ФГА и его изомера диоксиацетонфосфата (ДОАФ)) в пятиуглеродный акцептор СО₂ – рибулозо-1,5-бисфосфат, а также на получение продуктов фотосинтеза (сахароза, крахмал). В реакциях регенерации акцептора СО2, которые представляют собой внутримолекулярные перегруппировки фосфорсодержащих сахаров, участвуют трехуглеродные соединения (3-ФГА и ДОАФ), четырехуглеродное соединение (эритрозо-4-фосфат), пятиуглеродные соединения (рибозо-5-фосфат, рибулозо-5-фосфат, ксилулозо-5-фосфат), шестиуглеродные соединения (фруктозо-1,6-фосфат, фруктозо-6-фосфат) и семиуглеродные соединения (седогептулезо-1,7-фосфат, седогептулозо-7-фосфат). Превращения углеводов осуществляют следующие ферменты: фосфокиназы, переносящие остаток фосфорной кислоты от АТФ к рибулозо-5-фосфату и 3-ФГК, изомераза, фосфатазы, транскетолазы, переносящие двухуглеродные фрагменты, альдолаза и эпимераза. В реакции превращения рибулозо-5-фосфата в рибулозо-1,5-бисфосфат расходуется еще одна молекула АТФ, образованная в результате фотофосфорилирования.

Из реакций цикла для дальнейшего превращения в продукты фотосинтеза необходимо вывести молекулу фосфорсодержащего сахара. Такой молекулой с минимальным числом атомов углерода является 3-ФГА (или 3-ФГК). Поэтому для баланса цикла в него необходимо ввести три молекулы СО₂. Тогда при полном обороте цикла из пяти молекул 3-ФГК можно получить в конечном итоге три молекулы рибулозо-1,5-бисфосфата. При этом на осуществление реакций требуется 6 молекул НАДФН+Н (если из цикла уходит 3-ФГА) и 9 молекул АТФ.